微生物營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用品

接種環(huán)、酒精燈、9 mL無菌水、1 mL無菌吸管、無菌水、無菌平皿、玻璃刮鏟、滅菌五角星形圖案紙（牛皮紙或黑紙）、紫外燈箱、無菌鑷子、直徑0.6cm的無菌圓形濾紙片；或其它實(shí)驗(yàn)用品。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的基本要求

本實(shí)驗(yàn)是在已經(jīng)做了微生物的一些基本實(shí)驗(yàn)和綜合實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中應(yīng)簡(jiǎn)明地闡述實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、材料、?shí)驗(yàn)方法、觀測(cè)結(jié)果以及結(jié)果分析等內(nèi)容。

（一）擬訂實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膽?yīng)該寫明：通過何種設(shè)計(jì)方案，采用哪種方法，說明哪些因素對(duì)微生物生長(zhǎng)有影響，影響程度如何；從本次實(shí)驗(yàn)本人可以獲得哪些收獲等等。

（二）確定實(shí)驗(yàn)原理

對(duì) 自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案、方法從理論上說明依據(jù)。如微生物生長(zhǎng)需要哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括有機(jī)物、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素；微生物與氧氣的關(guān)系；微生物的生長(zhǎng)溫度范圍；微生 物生長(zhǎng)繁殖需要的酸堿度即pH值環(huán)境；紫外線對(duì)微生物的作用；化學(xué)藥劑對(duì)微生物的生長(zhǎng)抑制或殺死作用等等，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康撵`活選擇。

（三）確定實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定，可以是實(shí)驗(yàn)室已有的活菌種，也可以是自己從環(huán)境中分離得到的微生物材料。

（四）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法的確定也應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行。應(yīng)該包括菌種的選擇、配制何種培養(yǎng)基、需要哪些器材和藥品、怎樣接種、怎樣培養(yǎng)、怎樣觀察結(jié)果等等?？晒﹨⒖嫉膶?shí)驗(yàn)方法如下：

1、營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響

⑴制備培養(yǎng)基：本實(shí)驗(yàn)分組配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方見附錄1-8。培養(yǎng)基分裝試管，每管裝量4～5mL，0.1MPa滅菌30min后備用。

⑵孢子懸液制備：取無菌水1支，用接種環(huán)從黑曲霉斜面菌種管中挑取菌體2～3環(huán)，放入水中，充分混勻，備用。

⑶接種：每人取*、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培養(yǎng)液各一支，用1 mL無菌吸管按無菌操作法接種黑曲霉孢子懸液0.5 mL。本實(shí)驗(yàn)按每4人取一套培養(yǎng)基不接種作為對(duì)照。

⑷觀察：接種后，將培養(yǎng)管置28℃溫度下培養(yǎng)5～7d ,觀察黑曲霉菌絲及孢子生長(zhǎng)情況。★該試驗(yàn)用細(xì)菌類微生物作試驗(yàn)菌種能觀察到明顯的結(jié)果嗎？為什么？

2、氧氣對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

⑴菌懸液制備：用接種環(huán)按無菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大腸桿菌1～2環(huán)分別放入三支無菌水中制成菌懸液。

⑵接種：取已熔化并保溫在50℃左右的培養(yǎng)基6支，用無菌吸管分別及取菌懸液0.2 mL接種到培養(yǎng)管中，每種試驗(yàn)菌接種2個(gè)重復(fù)，接種后立即置振蕩器上混勻，并冷凝。

⑶培養(yǎng)：置培養(yǎng)管于28～30℃下培養(yǎng)3d。

⑷結(jié)果檢查：取出培養(yǎng)管，觀察并記錄每支培養(yǎng)管的上、中、下各層次中細(xì)菌的菌苔大小，菌體集中分布的位置，以了解氧氣對(duì)幾種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。

3、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

⑴接種：取牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基8支，用接種環(huán)按無菌操作法分別在斜面上劃線接種大腸桿菌與枯草桿菌，勿劃破培養(yǎng)基。

⑵培養(yǎng)：將已接種的斜面培養(yǎng)基，分別放在4℃、28℃、37℃和45℃四種溫度下培養(yǎng)。

⑶觀察：培養(yǎng)48h、72h后觀察生長(zhǎng)狀況，根據(jù)菌苔的大小確定其生長(zhǎng)zui適溫度。

4、氫離子濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

⑴培養(yǎng)基制備：分組按下列配方配制不同pH值的培養(yǎng)基，并用pH計(jì)校證pH值，然后分裝入試管中，每管裝量5～6 mL,0.1Mpa滅菌30min備用，見表。

⑵接種培養(yǎng)：取供試pH培養(yǎng)基三組用接種環(huán)按無菌操作法于試管中分別接入大腸桿菌、吸水鏈霉菌、黑曲霉。在37℃下培養(yǎng)48h。

⑶檢查結(jié)果：出取培養(yǎng)物，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5、紫外線殺菌試驗(yàn)

⑴制平板：取無菌平皿6套，將已熔化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基

不同pH值培養(yǎng)基配制表

按無菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵菌懸液制備：取試管無菌水2支，以無菌操作法分別取金黃色葡萄球菌和黏質(zhì)沙雷氏菌各2環(huán)，接入無菌水中充分搖勻，制成菌懸液。

⑶接種：將已倒入培養(yǎng)基的平皿分成2組，每組3個(gè)，一組接金黃色葡萄球菌，一組接沙雷氏菌，用無菌吸管吸取已制好的菌懸液各0.1 mL，分別在接種于二組平板上，用無菌玻璃刮鏟布均涂勻，隨即用無菌鑷子夾取無菌圖案紙一張，小心放在接種好的平皿中央。

⑷分組：將接種的六個(gè)平皿分為三組，每組一個(gè)金黃色葡萄球菌，一個(gè)黏質(zhì)沙雷氏菌。

⑸紫外線處理：將紫外燈先開燈預(yù)熱2～3min。再將上述平皿置于紫外燈下，打開皿蓋，在30cm距離處照射。一組照1min，1組照5min，1組照10min，小心地取下圖案紙，蓋上皿蓋。用黑布或厚紙遮蓋，送入培養(yǎng)室內(nèi)?！锎藭r(shí)能否不進(jìn)行遮蓋處理，直接拿出來培養(yǎng)？

⑹培養(yǎng)：將平皿于28～30℃溫度下培養(yǎng)48h。

⑺觀察：兩菌在不同的處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)狀況，即有無生長(zhǎng)、生長(zhǎng)數(shù)量多少、生長(zhǎng)的位置等。

6、化學(xué)藥劑對(duì)微生物的作用

⑴制平板：取無菌平皿3套，將已熔化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基按無菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵制備菌懸液：取無菌水3支，用接種環(huán)分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌各1～2環(huán)接入無菌水中，充分混勻，制成菌懸液。

⑶接種：用無菌吸管分別吸取已制好的菌懸液0.1mL接種于平板上，用無菌玻璃刮鏟涂勻。注意做好標(biāo)記。

⑷浸藥：將滅菌濾紙片浸入供試藥劑中。

⑸加藥劑：用無菌鑷子夾取浸藥濾紙片，注意把藥液瀝干，分別平鋪于同一含菌平

板上，注意藥劑之間勿互相沾染并在平皿背面做好標(biāo)記。

⑹培養(yǎng)：將平皿置于28℃下培養(yǎng)48～72h后觀察結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)材料

1、 活材料：培養(yǎng)3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培養(yǎng)24h的大腸桿菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、培養(yǎng)5d的吸水鏈霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培養(yǎng)24～48h的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌種；其它自選的微生物材料，包括實(shí)驗(yàn)室已有的和自己從環(huán)境中分離得到的均可。

2、 培養(yǎng)基：原則上可以參考以下培養(yǎng)基：*培養(yǎng)基、缺C培養(yǎng)基、缺N培養(yǎng)基、缺P培養(yǎng)基、缺K培養(yǎng)基、缺Zn培養(yǎng)基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂 10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；也可以自己選定其它合適的培養(yǎng)基。

3、試劑： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L檸檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L鏈霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合適的試劑。

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